第8章 基因组学基础 第一节 遗传标记 To use DNA you need a roadmap ? 一、遗传标记的发展 ? 二、遗传标记 ? 三、遗传标记的应用 ? 一、遗传标记的发展 1、形态学标记 ? 2、细胞遗传标记 ? 3、生化与免疫遗传标记 ? 4、遗传标记 ? ? 5、理想的遗传标记应具备的特 点 1、形态学标记 ? 形态学标记(morphological marker) 能够用识别和观察、明确显示遗传多样 性的外观性状。 ? 特点 简单直观，但标记数目少，多态性低，易受 条件的影响； 依据它进行选择的准确性差，所需时间较长， 选择效率也较低。 古代形态学标记 ? 公元前4000年，伊拉克的古代巴比伦石 刻上记载了马头部性状在５个世代的遗 传。 伯乐相马 按图索骥 2、细胞遗传标记 ? 细胞遗传标记(cytological genetic marker) 主要是指染色体核型（染色体数目、大小、 随体、着丝粒、核仁组织区等）、带型 （Q、G、C、R带型）和数量特征的变异等， 它们分别反映了染色体在结构上和数量上的遗 传多态性。 家猪X、Y染色体G带示意图 细胞遗传标记的特点 不易影响，呈孟德尔方式遗传。 ? 多态性集中表现在染色体高度重复DNA 结构的异染色质所在的部位。 ? 细胞遗传标记经常伴有对生物有害的表 型效应，难以获得相应的标记材料，或 者观测和鉴定比较困难，从而了细 胞遗传标记的应用。 ? 3、生化与免疫遗传标记 ? ? 免疫遗传学标记(immunogenetical marker) 以动物的免疫学特性为标记，包括红细胞抗原多态性 和白细胞抗原多态性。 ? ? 生化遗传标记(biochemical genetic marker) 主要是指在同一动物个体中具有相同功能的蛋白质存 在两种以上的变异体。 同工酶与等位酶 同工酶(isozyme)：电泳所可区分的同一 种酶（系统）的不同变化 ? 等位酶(allozyme)：由一个位点的不同 等位基因编码的同种酶的不同类型，其 功能相同但氨基酸序列不同 ? 等位酶分析的过程 材料的采集 研磨和酶的提取 酶的保存 淀粉凝胶制备 电泳 凝胶切片 酶的组织化学染色 数据分析 酶谱的记录与分析 生化与免疫遗传标记的特点 与形态学标识和细胞遗传标记相比，数 量更丰富，受影响更小，检测手段 简便，是一种较好的遗传标记。 ? 血液型和蛋白质型都是基因表达的产物， 局限于反映基因组编码区的遗传信息， 且标记的数量还比较有限，不能很好地 覆盖整个基因组。 ? 4、遗传标记 ? ? 遗传标记(molecular genetic marker) 是一种新的以DNA多态性为基础的遗传标 记. ? 随着生物学的发展，相继建立了RFLP、 VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多种 遗传标记检测技术，开创了遗传标记研究 的新阶段。 遗传标记的特点 无表型效应 ? 不受的和影响 ? 普遍存在于所有生物 ? 数量丰富等特殊优势 ? 5、理想的遗传标记应 具备的特点 ? ? ? ? ? ? ? 遗传多态性高; 检测手段简单快捷，易于实现自动化; 遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基因的3种 基因型。 标记遍布整个基因组； 准确性，能正确反映动物的真实遗传，即标记是经济 性状基因，还是与影响重要性的性状连锁。 实验重复性好（便于数据交换）； 开发成本和使用成本尽量低廉； 二、遗传标记 1、RFLP：性片段长度多态性 ? 2、TRS：重复序列标记 ? 3、SNP：单核苷酸多态性 ? 1、性片段长度多态性 ? ? RFLP restriction fragment length polymorphism ? 最早应用于动植物遗传学研究的标 记技术 RFLP的原理 ? ? ? ? ? 利用性内切酶消化基因组DNA，形成大小 不等、数量不同的片段， 经电泳分离， 通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜 (尼龙膜或硝酸纤维素膜)上， 然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高 辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片 段进行杂交。 不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得 RFLP谱带表现出不同程度的多态性. RFLP示意图 性片段的制备 电 泳 Southern 印 迹 与放射性探针杂交 放射性自显影 RFLP的特点 呈共显性遗传、无表型效应、不受年龄 性别的影响等优点。 ? 分析一次只能检测1个位点，多态信息含 量较低，而且操作复杂，耗时费力，成 本高，并且对模板DNA需求量大。 ? PCR－RFLP 将PCR技术用于RFLP分析，即PCRRFLP。 ? 该技术先用1对引物性扩增基因组的 某一高变区，然后用性内切酶消化 PCR产物，电泳检测多态性。 ? PCR-RFLP分析省去了探针的制备、分 子杂交等繁琐的过程，DNA需求量也少， 大大简化了传统的RFLP技术。 ? PCR－RFLP的应用 √MstⅡ酶切位点 Pro Glu Glu ??? ??? CCT GAG GAG ??? ??? ??? ??? CCT GAG GAG ??? ??? ??? ??? CCT GAG GAG ??? ??? ??? ??? CCT GTG GAG ??? ??? ??? ??? CCT GTG GAG ??? ??? ??? ??? CCT GTG GAG ??? ??? Pro Val Glu ×MstⅡ酶切位点消失 PCR-RFLP 1 2 3 正常 杂合 异常 2、重复序列标记 tandem repeated sequence,TRS ? 真核生物基因组中的可变重复序列 （variable number tandem repeated sequence, VNNTR）有两类:小卫星和微 卫星，两者具有高度的变异性。 ? (1) 小卫星 (minisatellite DNA) 小卫星重复单位的核心序列为15一76bp ? 近缘和个体间的小卫星核心序列有 着一定的同源性，在一定的条件下可以 相互杂交。 ? DNA指纹图谱原理 ①选择在VNTR序列上没有酶切位点的限 制性内切酶将动物总基因组DNA切成不同长度 的片段 ? ②以VNTR中序列作为探针，进行 Southern杂交， ? ③由于不同个体的重复序列的数目和 不同，形成的杂交谱带具有个体的性，人 们称为DNA指纹图谱 (DNA fingerprinting, DFP) ? VNTR示意图 1 1 2 3 A B C 2 3 VNTR变异的原理示意图 DFP的特点 多态性检测率高， ? 位点呈共显性遗传 ? 个体具有高度性 ? 技术复杂、成本高，有时谱带过于复杂 ? ⑵微卫星（microsatellite DNA, MS) 又称简单序列重复( sequence repeat,SSR) ? 是高度重复序列，广泛存在于真核生物 基因组，重复单位的核心序列为2~6bp。 ? 微卫星遗传标记的原理 ? 以微卫星DNA标记两侧性序列设计 引物，通过PCR技术扩增微卫星片 段，扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳分离，不同个体间因核心序列的重复 次数不同而产生DNA多态性。 微卫星遗传标记示意图 A B PCR扩增 1 2 3 凝胶电泳 AA AB BB 微卫星遗传标记示意图的特点 分布广泛均匀 ? 多态信息含量丰富 ? 呈共显性遗传 ? 稳定性好，可比性强 ? 分析技术易于实现自动化 ? 开发成本高 ? 微卫星标记的应用领域 ? ? ? ? ? ? 遗传图谱的构建 连锁分析特殊的基因（如致病基因） 姻亲分析样品鉴定（如父本分析、血析、 等号样品分析、杂种分析） 和居群的遗传多样性 群体遗传学分析（如有效群体大小、群体遗传 结构、群体分化、迁移与基因流动） 生物学 Microsatellites and disease ? Huntington’s disease – Huntingtin gene of unknown (!) function – Repeats #: 6-35: normal; 36-120: disease ? Friedrich ataxia disease – GAA repeat in non-coding (intron) region – Repeats #: 7-34: normal; 35 up: disease – Repeat expansion reduces expression of frataxin gene 3、单核苷酸多态性标记(SNP) single nucleotide polymorphism ? 是指染色体上的某个存在单个碱基的变 化，包括单碱基的转换、颠换、插入及 缺失等。 ? ? SNPs in human population Inter-genic regions Every 1400bp Coding regions Every 1430bp SNP标记的特点 ? ⑴高密度 SNP是基因组中最普遍、频率最高的遗传 标记。单个SNP虽然只有两个等位基因， 多态信息含量不如微卫星位点，但其高密 度弥补了其不足。 ? ⑵代表性 某些位于基因表达序列内的SNP(coding SNP,cSNP)，有可能直接影响蛋白质结 构或表达水平，鉴别cSNP对于复杂表型 性状与基因变异之间的关联分析具有重 要意义。 ? ⑶易实现自动化分析 双等位标记，检测时只需“有或无”表 示。DNA芯片技术实验了SNP分析的高 通量、微型化和自动化。 第二节 基因组学 一、产生背景及概念 ? 二、基因组学分类 ? 三、结构基因组学 ? 四、功能基因组学 ? 五、比较基因组学 ? 一、产生背景及概念 ? 1. 背景： 1985年提出人类基因组计划（HGP）， 随着 HGP 的提出和实施，产生的基因组 学。 2. 概念 ? 以生物学技术、计算机技术和 信息网络技术为研究手段， ? ? 以生物体内全部基因为研究对象， 在全基因背景下和整体水平上探索生命 活动的内在规律及其内外影响机制 的科学。 Genome sizes Organism DNA length 0.5 Mb 3 Mb in 410 copies! 4.5 Mb Genes 470 3 200 4 400 Mycoplasma genitalium Deinococcus radiodurans Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans 12 Mb 9 7 Mb 6 200 22 000 Drosophila melanogaster Homo sapiens 120 Mb 3200 Mb 18 000 32 000 3、基因组学的发展历程 ? 流感嗜血杆菌( haemophilus influenzae) 1995 年7 月第一个细菌基因组全序列发表,大 小为1.8 Mb。含1703 个基因或阅读。这是 微生物乃至整个生物学领域的一个里程 碑.(Science) ? 1997 年9 月,大肠杆菌的完整基因图谱已 绘制成功, 基因组全序列完成, 全长为 5Mb ,共有4 288 个基因,同时也搞清了所 有基因产物的氨基酸序列. ? 啤酒酵母，1997年，第一个真核生物基 因组图谱公布。 秀丽线虫( caenorhabditis elegans) ? 1998 年12 月完成了基因组测序。基因组大小 100 Mb ,分布于6 条染色体,预测有19，099 个 基因。 ? 果蝇 ? Celera公司2000 年3 月宣布了基因组全序列为 180 Mb。有13 601 个基因,其中一半的基因功 能还没有搞清楚,有1 600 个碱基跨度区仍未能 完全测序。 ? ? 2000 年12 月,第一个植物基因组——拟南 芥基因组被全部测序,遗传图谱、物理图 谱建立,序列大小为125 Mb。基因组测序 区段覆盖了全基因组的115.4 Mb ,分析共 含有25 498 个基因, 编码蛋白来自11 000 个家族。 ? 2001年2月中旬，《Nature》与《Science》 分别发表了人类基因组工作框架图,报告 人类基因组共有30 亿个碱基对, 预测编码 基因31 000个,比最初预测的10 万个编码 基因数大大减少。 ? 2002年4月，水稻基因组图谱公布。 ? 2002年 小鼠、疟原虫和按蚊基因组测序完成 ?鼠基因组共有约27亿个碱基对，比人类 少15％，但其包含的基因数目约在3万 个左右，与对人类基因数的最新估计非 常接近。 人被蚊子咬之后5到10分钟，疟原虫孢子就 会到达肝脏，入侵肝细胞，在这里它们可以 躲过人体免疫系统的。孢子侵吞肝细胞 的营养，大量地繁殖，大概一个星期之 后胀破肝细胞跑出来，将数以百万计的新孢 子进入血液。新的孢子马上入侵红细胞， 再次逃过免疫系统的追杀。它们以血红蛋白 为食，继续繁殖，大概两天后红细胞， 产生更多的孢子入侵其它红细胞……用不了 多久，2/3的红细胞都会被疟原虫占领。疟 原虫在血液里这种周期性的繁殖过程，就会 导致病人三天两头地发高烧、打寒战。 疟原虫 两个红细胞 疟原虫的 裂殖子 人肝细胞内间日疟原虫（Plasmodium vivax）细胞前期成熟裂殖体疟原虫是疟疾 的病原体，分布区几乎遍及全球。间日疟 原虫是四种寄生于人体的疟原虫之一。 2003年 人类基因组计划宣布，人类基因组序列 图绘制成功，人类基因组计划的所有目 标全部实现 ? 人类遗传变异图谱研究以及黑猩猩基因 组测序计划开始 ? 2003年11月，世界上首个复杂生物体的 蛋白图谱－－果蝇蛋白图谱公布，从而 实现了只显示遗传密码的基因图谱到揭 示遗传密码功能的蛋白图谱的飞跃。 ? 这个果蝇（Drosophila melanogaster） 蛋白图谱发表在《科学》的网络版 上 ? 这篇研究发布的这个含有7,000多个果蝇 蛋白的图谱含盖了这些蛋白之间超过 20,000种不同的互作。 ? 这些果蝇蛋白有许多与人类蛋白类似， 适于作为研制小药物如用于治疗癌 症、心脏病和糖尿病的口服药片等的靶 点 ? 2004年３月１日 ? 多国科学家组成的两个研究小组宣布绘制出鸡 的基因序列草图和遗传差异图谱。 ? 科学家选取了家鸡 的远祖——红原鸡为 测绘对象，绘制出了 草图中约10亿个碱基 对，相当于人类的三 分之一。 ? ?科学家在９日出版的《Nature》上载文说， 分析发现，红原鸡约有２万到2.3万个遗传基因， 与人类数量基本持平，其中有60％与人类相同。 意外的发现 ? ? 鸡基因组的分析还仅仅是开始，不过已 经得出了一些出人意料的结果。 科学家们发现，控制鸡生成角蛋白的基因与预 想的不同。 ? 角蛋白构类的头发、指甲，以及鸟类的喙 和羽毛，科学家一直认为哺乳动物和鸟类的角 蛋白来源相同。但图谱显示，鸡的角蛋白基因 与哺乳动物的区别很大。 ? 科学家由此推测，角蛋白可能进化出了两 次。 意外的发现 另外，此前科学界一致认为鸡没有嗅觉， 但是分析结果表明鸡具有大量的嗅觉基 因，味觉基因却很缺乏。 ? 分析还发现，鸡缺乏人类所具有的产生 乳汁、唾液和牙齿的基因。 ? 鸡基因组研究的意义 鸡是研究低等脊椎动物和人类等哺乳动 物的一种比较理想的中介。 ? 将人类基因组与鸡等其他生物的基因组 进行比较，有助于更深入理解人类基因 的结构和功能，进而开发治疗疾病的新 手段，对于培育优质鸡种、改善食品安 全、控制病毒的蔓延也有重要意 义。 ? 鸡的进化研究 ? 鸡是种常见的家禽，长期受到进化生物学家的 青睐。它的基因序列也有助于科学家了解农业 和进化学上重要特性的遗传学基础。 转基因小鸡 对鸡和人类的基因组进行比较后发现约 七千万个碱基对是共有的。 ? 这暗示着在大约三亿一千万年前二个物 种从共同祖先分化出来的时候，遗传物 质具有守恒性。 ? 鸡和所有的 哺乳动物多 起源于恐龙 鸟类的祖先——始祖鸟 “分道扬镳” ?在鸟类和哺乳动物分离的时 候，鸡获得了生成羽毛和喙 的蛋白质的基因，而哺乳动 物获得了毛皮蛋白质的基因， 了与蛋清和蛋黄有关的 基因。 ?鸡的基因组比哺乳动物的紧凑的多，它拥有20万到 23万个基因，但仅有十亿个DNA碱基，而同样多的 基因人类需要三十亿个碱基。鸡的基因数量与哺乳 动物的相当，但它的基因组含有重复的“垃 圾”DNA的数量很少。 我国科学家在鸡基因组学研究上的重大突破 中国科学院基 因组研究所在国际 合作的框架下参与 和主持完成的原鸡 基因组和家鸡基因 组多态性研究并于 2004年12月9日发 表在《自然》 上以主题科学论文 的形式发表。 《Science》发表论文 我国家蚕 基因组研究获国际认可 2004年12月10日 西南农业大学家蚕基因组研究群体的研究论文《家蚕 基因组框架图》，于12月10日在国际顶尖科研 《Science》上发表，这标志着家蚕基因组研究 已得到国际学术界的认可。 ?丝腺是合成茧丝蛋白质的生物器官，是蚕丝产 业的生物学基础。 ?科学家通过分析家蚕基因组和基因表达谱，发 现了1874个家蚕丝腺基因，其中97％为新发 现；发现了丝腺中激素活动的； ?科学家甚至比较了家蚕与被称为“生物钢”的 蜘蛛丝的生产者——蜘蛛的基因构成，发现了它 们共同拥有的１０７个基因。 ?这些功能基因的获得和功能分析的深入 开展，将彻底突破茧丝蛋白质合成相关 基因克隆和研究的瓶颈。 ?而随着家蚕丝腺基因研究的深入， 中国将很快在丝蛋白质结构，克服 丝绸天然加工弱点等重要产业技术的研 发方面取得突破。 二、基因组学分类 ? 1、根据研究对象分： 动物基因组学、植物基因组学、肿瘤基因组 学、药物基因组学、基因组学等。 ? 2、 根据研究的重点分： 结构基因组学、功能基因组学、比较基因组 学 三、结构基因组学 （一） 概念和目的 ? （二） 基因图谱 ? （三） 结构基因组学研究常用方法 ? （一）概念和目的 ? 以全基因组测序为目标的基因结构研究弄 清基因组中全部基因的和结构，为基 因功能的研究奠定基础。 其目的是建立高分辨的遗传图谱、物理图 谱、图谱和序列图谱。 ? （二） 基因图谱 1. 遗传图谱（连锁图谱） ? 2. 物理图谱 ? 3. 图谱（表达图谱） ? 4. 序列图谱（水平的物理图谱） ? 1. 遗传图谱（连锁图谱） ? 概念：指基因或标记在染色体上的 相对与遗传距离，用厘摩（cM）表 示。 1cM的遗传距离表示在100个配子中有1 个重组子。在哺乳动物中，遗传图谱上 1cM的距离大约相当于物理图谱上1 000 000bp。 ? ? 通过该图谱可分清各基因或标记之 间的相对距离与方向，如靠近着丝粒或 端粒。 该图谱的构建是以位于同一染色体相邻 的2个基因或遗传标记的重组率为基因， 因而需要有参考家系和遗传标记或 基因作为研究基础。 ? 2. 物理图谱 ? ? ? 指DNA序列上两点间的实际距离。 用于确定各遗传标记间的物理距离有两种物理图谱： （1）以已定位的DNA序列标记位点（STS）为位标， 以DNA实际长度为图谱距离的基因组图谱。 （ 2 ）由 YAC 和 / 或细菌人工染色体（ BAC）连续克隆 重叠群组成的物理图谱。 ? 3. 图谱（表达图谱） ? 以EST为位标，根据顺序的和距离绘 制的图谱，它是染色体DNA某一区域内所有可 序列的分布图，是基因图的雏形。 ? 方法：用已在染色体定位的 YAC DNA 或 BAC DNA 为探针，与所有可能相关的各组织 cDNA 文库杂交，寻找其同源克隆并做进一步分析。 4. 序列图谱（水平的物理图谱） 以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘 制的图谱。 ? 既包括可序列，也包括非序列， 是序列、调节序列和功能未知序列 的总和。 ? （三）结构基因组学研究常用方法 ? ? 1. 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 2. 毛细管电泳 ? ? 3. 基因芯片技术 4. 全基因组随机测序 四、功能基因组学 1. 概念： ? 利用结构基因组学提供的信息，以高通 量，大规模实验方法及统计与计算机分 析为特征，全面系统地分析全部基因的 功能。 ? 研究角度包括：生物学功能、细胞学功 能、发育学功能等。 ? 2.功能基因组学常用方法和技术 ? ? ⑴ RNA干扰技术（RNAi） ⑵蛋白质组学研究 ? ? ⑶生物信息学研究 等。 RNA干扰技术（RNAi） ? 将一段dsRNA导入机体或细胞后，与它有同源序列的 基因的表达被干扰或的现象。dsRNA依赖的 后基因沉默。1998，Fire，线虫 作用机制 ? A. Dicer 和Slicer依赖模式: 果蝇胚胎细胞和培养细胞 S2 B. 随机降解“PCR”模型: 果蝇，线虫，真菌 秀丽新小杆线 虫（C. elegans） 蛋白质组学(proteomics) 蛋白质组( proteome ) : 是由学者 Wasinger 等[21 ]于1995 年提出的,是指由 基因组编码的全部蛋白质。 ? 蛋白质组学(proteomics) 就是指研究细胞 内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。 ? 生物信息学 ? 生物信息学是以计算机为工具,用数理及 信息科学的理论和方法研究生命现象,对 生物信息进行储存、检索和分析的一门 学科。 五、比较基因组学 ? 利用人类基因组与模式生物基因组之间 编码顺序上组织结构上的同源性，发现 和克隆人类和其他的基因，提示基 因功能，从而阐明的进化关系及基 因组的内在结构。 人类基因组计划 （flash动画演示) ? introduction 人类基因组计划（flash动画演示) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? section1:mapping section2:building libaries section3:subclones section4:Ecoli storage section5:preparing DNA for sequencing reactions section6:sequencing reactions section7:products of sequencing reactions section8:separating the sequencing products section9:reading the sequencing products section10:assembing results section11:sequencing 24 hours section12:gap and 99.99% precision PCR聚合酶链式反应 ? Polymerase Chain Reaction ? 是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法. ? 它包括三个基本步骤: ? ? ? ? (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃ 左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸 Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最 适温度下,以目的DNA为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将 使目的DNA扩增一倍,所以经25-35轮循环就可使DNA 扩增达106万倍。 PCR movie带土字旁的男孩名字